Siembra de microorganismos

Para estudiar las características de los microorganismos (forma, estructura, tamaño, consistencia, cromo génesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados según el tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios sólidos y líquidos.

La mayoría de las bacterias son de rápida multiplicación y agotan los nutrientes de los medios de cultivos en forma acelerada. Las mismas una vez sembrada en los medios de cultivos deben incubarse a una temperatura óptima de crecimiento y al abrigo de la luz.

 Antes que nada debemos dejar en claro…Que son las bacterias

Las bacterias son organismos unicelulares procariontes, esto quiere decir que están formados por una sola célula carente de núcleo.Su ácido desoxirribonucleico (ADN) se encuentra libre en el citoplasma y no tienen organelos, como las mitocondrias, cloroplastos o aparato de Golgi. A pesar de su sencilla organización celular, cuentan con una pared celular (capa de polisacáridos) que envuelve la célula proporcionándole rigidez y protección. Son tan pequeñas que es imposible verlas a simple vista, solamente cuando llegan a agruparse formando colonias es cuando las podemos reconocer.

Además de contar con una pared celular, cuando las condiciones ambientales se tornan hostiles muchas bacterias forman en su interior estructuras de protección llamadas endosporas, las cuales contienen el material genético y las sustancias necesarias para poder sobrevivir. Algunas son tan resistentes que permiten a la bacteria sobrevivir a altas temperaturas e incluso a largos periodos de tiempo. Se reproducen asexualmente por medio de una forma de división celular denominada fisión binaria, que produce copias genéticamente idénticas a la célula original. En condiciones ideales, algunas bacterias se duplican en cuestión de minutos por lo que podrían en principio, dar origen a una población de millones de bacterias en poco tiempo.

Son prácticamente omnipresentes ya que habitan casi todos los hábitats de la Tierra, los científicos las consideran como los seres más numerosos del planeta. Una de las razones por las cuales son tan exitosas es porque pueden utilizar una amplia variedad de fuentes de alimento. Algunas bacterias llevan a cabo la fotosíntesis, proceso mediante el cual utilizan la energía lumínica y el dióxido de carbono para sintetizar su alimento (autótrofas), algo parecido a lo que realizan las plantas. Otras obtienen su energía de moléculas inorgánicas como azufre, amoniaco o nitritos (quimiolitótrofas) y algunas más se alimentan de la materia orgánica en descomposición (quimioorganótrofas). Las bacterias desempeñan funciones que son importantes para otras formas de vida. Muchas son endosimbiontes, esto quiere decir que viven dentro de otros organismos o en estrecha asociación con ellos. Por ejemplo, existen bacterias que habitan en el tracto digestivo de los animales, incluyendo el ser humano, y les ayudan a procesar los nutrimentos que por sí solos serían incapaces de digerir. A pesar de las ventajas que obtenemos de las bacterias, principalmente en la obtención de alimentos, medicamentos e inclusive en la industria, muchas son causante de enfermedades, algunas con importantes repercusiones en la historia humana. Por ejemplo, la “peste bubónica” en la cual murieron 100 millones de personas en Europa en el siglo XIV, fue causada por una bacteria.

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos.

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

La evolución de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Tipos básicos de medios de cultivo

Atendiendo a su estado físico:

·         Líquidos

        ·         Semisólidos

·         Sólidos

Atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancias añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:

Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

Bibliografía

biodiversidad mexicana. (2014). Obtenido de biodiversidad mexicana: http://www.biodiversidad.gob.mx/especies/gran_familia/Bacterias/bacteria.html

blogspot. (agosto de 2012). Obtenido de blogspot: http://meplunesr.blogspot.mx/2011/05/universidad-nacional-experimental-simon.html

micromundo. (s.f.). Obtenido de micromundo: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm